副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测试剂盒说明书 【产品名称】 通用名称:副猪嗜血杆菌实时荧光PCR检测试剂盒 【包装规格】50T/盒 【预期用途】 本试剂用于检测组织病料、拭子、分泌物、血液及培养物中的副猪嗜血杆菌(HPS)的DNA,检测结果可用于临床中HPS感染的辅助诊断。 【检验原理】 1本试剂盒采用Taqman探针技术,对HPS基因组的保守区设计探针引物并标记不同荧光基团,配以相应试剂进行聚合酶链式反应(PCR),应用实时荧光定量PCR检测平台,通过荧光信号的变化实现对样品中HPS核酸的快速检测。 2 本试剂盒荧光PCR体系中含有内置参照(内标),通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物,避免PCR假阴性。 【主要组成成份】
试剂名称 |
规格与装量 |
主要成分 |
HPS-反应液 |
950μL/管×2管 |
引物、探针、dNTP、Mg2+、PCR缓冲液等 |
DNA 酶混合液 |
100μL/管×1管 |
热启动Taq聚合酶 |
HPS-阳性对照 |
50μL/管×1管 |
含HPS基因组保守位点阳性核酸序列 |
HPS-阴性对照 |
500μL/管×1管 |
灭菌生理盐水 |
HPS-内置对照 |
50μL/管×1管 |
含内置参照(内标) |
核酸释放剂 |
250μL /管×1管 |
十二烷基硫酸锂,氯化钠等 |
备注: 1)不同批号产品的成分之间不可以混用或互换。 2)试剂盒内的生物样本均已经灭活处理。 3)自备试验器材:DNase/RNase-free处理的1.5 mL离心管、0.2 mL PCR反应管(8联管或96孔板);台式离心机;台式震荡混合器;分离器及各种规格的移液器及灭菌吸头(10μL,200μL,1000μL)。 【储存条件及有效期】 试剂应避光密闭储存于-20±5℃;试剂盒有效期为12个月,避免反复冻融。 【适用仪器】 适用于宏石Slan-48P/96P、ABI系列、安捷伦Mx3000P、Bio-rad CFX系列等荧光PCR仪。 【样本要求】 1 适用样本类型:组织病料、拭子、分泌物、血液样本及培养物等。 2 样本处理: 2.1 组织样品处理:取约1g组织病料,于研磨器具中研磨,加入1.2mL生理盐水研磨至匀浆,转移至1.5 mL离心管,取悬液以生理盐水稀释10倍后待用。 2.2 无溶血的血清或血浆、培养物:无需预处理。 2.3 其它样本类型:建议使用商业化核酸提取试剂盒进行DNA的提取和纯化。所提取的核酸建议立即进行检测,否则请于-20℃±5℃冻存,保存时间不超过6个月。 【检验方法】 1 试剂准备(在试剂准备区进行) 1.1 取出包装盒中的各组分(酶除外),室温放置,待其温度平衡至室温后,混匀后瞬时离心备用; 1.2根据待测样本、阴性对照以及阳性对照数量,按比例(HPS-反应液38μL/测试+DNA 酶混合液2μL/测试+ HPS-内置参照0.5μL/头份)取相应量的试剂,充分混匀成PCR-Mix,瞬时离心后备用。 1.3 将上述准备好的试剂转移至样本处理区,待用。 2样本处理及加样 (在样本处理区进行) 2.1 向每个反应管中加入5μL核酸释放剂; 2.2 取阴性对照、阳性对照与待测样本各5μL分别加入对应PCR反应管,混匀后室温静置10min; 2.3 向每个反应管中分别加入40μL PCR-Mix,盖上管盖,短暂离心,转移至扩增区。盖好管盖,转移至扩增区。
3 PCR扩增(在扩增与分析区进行,请参照各仪器使用说明书进行设置) 3.1将PCR反应管放入扩增仪,按对应顺序设置阴性对照、阳性对照以及待测样本名称。 3.2 荧光检测通道选择: (1)选择FAM通道检测HPS核酸;(2)选择HEX或VIC通道检测内置参照。(3)设置反应体系为50μL。 3.3 循环参数设定:
|
步骤 |
温度 |
时间 |
循环数 |
1 |
逆转录 |
50℃ |
30分钟 |
1 |
2 |
cDNA预变性 |
95℃ |
2分钟 |
1 |
3 |
变性 |
95℃ |
15秒 |
40 |
4 |
退火,延伸及荧光采集 |
60℃ |
30秒 |
40 |
5 |
仪器冷却 |
25℃ |
10 秒 |
1 |
设置完毕,保存文件,运行反应程序。 4 结果分析(请参照各仪器使用说明书进行设置) 4.1 反应结束后自动保存结果,仪器将对结果进行自动分析,给出Ct值。注意查看结果的扩增曲线的形状,存在Ct值的结果需呈S型曲线。 4.2 用户也可根据实际情况自行调整,基线起点值可以在3~15、基线终点值可设在5~20,调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线,使各项参数符合下述“5 质量控制”中的要求。 5 质量控制 5.1 HPS-阴性对照:FAM通道无Ct值显示或典型的扩增曲线,且HEX通道Ct值≤36; 5.2 HPS-阳性对照:FAM通道Ct值≤30,且具有典型的扩增曲线; 5.3 以上要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行。 【检验结果的解释】 1 测定FAM 通道Ct值≤35,且具有典型的扩增曲线,报告为HPS阳性; 2 测定FAM 通道35<Ct值≤40,且具有典型的扩增曲线,报告HPS可疑,应重新进行检测,如复检无Ct值,则报告HPS阴性,反之报告阳性。 3 测定FAM 通道无Ct值显示或者典型的扩增曲线,同时HEX通道Ct值≤36,报告为HPS阴性;若HEX通道Ct值> 36或无显示,则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验。 【检测方法的局限性】 1 样本检测结果与试剂盒运输、样本收集、处理、运送及保存质量有关; 2 如果样本处理时没有控制好交叉污染,可能出现假阳性结果; 3 阳性对照、扩增产物泄漏,可能导致假阳性结果; 4 病原体流行毒株发生变异,可能导致假阴性结果; 5 不同核酸提取方法存在提取效率差异,可能导致假阴性结果; 6 试剂运输,保存不当或试剂配制不准确,可能导致试剂检测性能下降,出现假阴性或定量不准确的结果; 【产品性能指标】 本试剂盒检测企业工作参考品,阴、阳性符合率均为100%;精密度试验表明:批内和批间重复性好,检测结果Ct值的变异系数均<3%。与感染部位相同或感染症状相似的其他病原无交叉反应。 【注意事项】 1本试剂盒检测结果仅做诊断辅助,使用前请仔细阅读本说明书。 2 实验前请熟悉和掌握需使用的各种仪器的操作方法和注意事项,对每次实验进行质量控制。 3 实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范,实验人员必须进行专业培训,实验过程严格分区进行,所用消耗品应灭菌后一次性使用,实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备,各区各阶段用品不能交叉使用。 4 所有的试剂在使用前,均需在室温下充分融化、混匀后使用。 【生产企业】 企业名称:湖南国测生物科技有限公司 生产地址:长沙市宁乡高新区湖南省大学科技产业园1栋 公司网址:www.xnfyzr.com 邮 编:410000 电 话:0731-89516668 传 真: 0731-89516669 |